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Entwicklung, Charakterisierung und Anwendung eines laserbasierten Drucksystems für lebende Zellen
Mit der Herstellung von autologem Gewebeersatz und vollständigen Organen aus patienteneigenen Zellen wird die Hoffnung verbunden, Leiden therapieren zu können, die derzeitig noch unheilbar sind. Allerdings macht die Komplexität von natürlichen Geweben es notwendig, neue technische Methoden zu entwickeln, die eine naturgetreue 3D Kopie der Gewebestörung des Patienten herstellen können. Eine viel versprechende Lösungsmöglichkeit dieses Problems ist die Weiterentwicklung von 3D-Drucktechniken für die Herstellung von autologem Gewebeersatz und lebenden Organen. Für dieses Anwendungsgebiet wurden in den letzten Jahren viele unterschiedliche Drucktechniken adaptiert, unter anderem ein direktes Laserschreibverfahren, das auf dem Laser-induzierten Vorwärtstransfer (LIFT) basiert. Hierbei funktioniert der eigentliche Materialübertrag im Gegensatz zu anderen Drucktechniken düsenfrei, da das Zell-Fluid-Volumen direkt aus einer flüssigen Schicht ausgetrieben wird. Das Zell-Fluid-Gemisch wird dafür vor dem Druckprozess als homogener Film auf einem beschichteten Glasträger aufgetragen, dem sogenannten Donor. Dieser wird planparallel zu einem weiterem Glasträger (Kollektor) befestigt. Für den Übertrag des Zell-Fluides wird ein geringer Bereich der Absorptionsschicht durch den einfallenden Laserpuls verdampft, dadurch bildet sich eine Dampfblase aus, die die Zellfluidschicht lokal ausbeult und beschleunigt. Das Kollabieren der Dampfblase mündet in der Ausbildung eines Fluidjets, der das Zellfluid vom Donor zum Kollektor “fließen“ lässt. Durch den Einsatz von biologischen Fluiden, die in einen gelartigen Zustand mittels geeigneter chemischer oder physikalische Wechselwirkung überführt werden können, sind auch komplexe 3D Zell-Geometrien mit dieser Technik realisierbar. Diese Arbeit präsentiert die Ergebnisse der Adaptierung der fundamentalen LIFT-Technik für den Zelldruck und die Untersuchung verschiedener Einsatzgebiete dieses Drucksystems. Da wenig über den eigentlichen Übertragungsprozess bekannt war, wurde ein stroboskopischer Kameraaufbau entwickelt, mit dem sich der Jetentstehungsprozess sowie Einflüsse auf das Übertragungsverhalten dokumentieren ließen. Es konnte gezeigt werden, dass sich trotz nichtlinearer Zusammenhänge der Prozessparameter bei Kenntnis der Fluidcharakteristika das Übertragungsvolumen, einhergehend mit den gedruckten Zellmengen, in einem weiten Bereich gezielt variieren ließ. Außerdem konnte anhand der zeitaufgelösten Bildfolgen der Jetübertragung ein theoretisches Modell abgeleitet werden, mit dessen Hilfe auf die Fluidströmungen innerhalb des Jets geschlossen werden konnte. Durch den nachgewiesen schädigungsfreien Übertrag unterschiedlicher Zelltypen konnten lebende dreidimensionale mono- und multizellulare Konstrukte mit dieser Drucktechnik erzeugt werden, die eine Vielzahl neuer in-vitro- und in-vivo-Ansätze eröffneten. Außerdem konnte mit dem gedruckten 3D Zellarray eine neue Methode vorgestellt werden, die die grundlegende Untersuchung von Zell-Zell- und Zell-Umgebungs-Interaktionen einer beliebigen Anzahl unterschiedlicher Zelltypen ermöglicht. Ein Überblick über die jüngsten Veröffentlichungen im Bereich der laserbasierten Zelldrucksysteme zeigt, dass diese Technik weltweit von einer steigenden Anzahl wissenschaftlicher Arbeitsgruppen verwendet wird. Aktuell sind im Verlauf dieser Arbeit elf peer-reviewed Publikationen sowie zahlreiche Beiträge auf Fachkonferenzen entstanden. The biofabrication of autologous tissue substitutes and entire organs raises the hope to cure diseases by patients´ own cells that are still beyond remedy. To address this issue the development of new biofabrication methods are required, that are able to generate a 3D blueprint of the patient disorder mimicking the native archetype and tissue formation. One way of solving this technical problem is further development of 3D printing techniques in order to construct required autologous tissue substitutes and living organs. Over the last decade various printing techniques were adapted for this purpose including a laser-based direct write technique based on laser-induced forward transfer (LIFT). Compared to other printing approaches, this printing technique operates orifice-free, since deposition of the cell compound takes place by sheering a tiny cell-fluid volume out of a liquid layer. Therefore, the cell compound was bladecoated as a thin layer on a slide coated with an energy-absorbing material layer, referred as donor-slide, and mounted upside down in the setup facing a second slide (collector-slide). In brief, laser pulses are focussed through the donor-slide onto the energy-absorbing material layer which is evaporated locally at the focal point. This rapid energy deposition leads to the generation of a jet dynamic resulting in the deposition of a tiny volume of cell fluid on the collector-slide. Even complex 3D cell structures can be realized with this printing technique by using fluids, which are polymerizing under appropriate physical or chemical conditions. This thesis presents results of work on further development of the fundamental LIFT technique towards a bioprinting system and exploration of various applications of this system. Furthermore, a stroboscopic imaging setup was built up in order to visualize the formation of the jet and influences of process parameters onto the jet, since little was known about the jet dynamic resulting in the deposition of a tiny volume. It could be demonstrated, that the printed droplet volume and cell amounts can be adjusted in a wide range by knowing the fluid characteristics in spite of the fact that there is no linear relationship between the process parameters. Moreover, a theoretical model of the jet formation could be established by means of the time-resolved images, which enables evaluation of critical flow forces inside the jet. After verifying that the laser printing procedure has no negative influence on different printed cell types, living 3D mono- and multicellular constructs were generated by means of this printing technique, open up a wide range of new in-vitro and in-vivo studies. Furthermore, by printing multiple cell types in a 3D array a new biological test platform could be presented, enabling the study of complex and dynamic relationships between cells and their local environment. An overview of reports on laser-based bioprinters indicates that this technique is constantly gaining wider acceptance and popularity among scientists worldwide. To date, work performed in the framework of this thesis has resulted in more than 11 peer reviewed publications and numerous conference contributions.
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